临床意义：
　　在人工受精（IUI）周期中，精子与精清分离后，可直接放入子宫中。如果精液直接注入子宫中，精浆中的前
　　列腺素就会引起子宫的收缩。存在于精浆中的其他物质，如去获能因子也会被除去。因此，只有经过清洗的精
　　子才够直接应用与辅助受精的各项技术，例如IVF，GIFT和ICSI。

样本：
　　精液需经手淫收集到医院指定的无菌塑料容器内。必须在1小时以内处理。其他方法不推荐，但可以经研究使
　　用。不能使用常规避孕套收集精液，因为避孕套内含有杀精子的成分，影响精液分析结果。如必须使用避孕套
　　，则由实验室提供特殊的避孕套。

患者准备：
　　患者需与医生预约辅助受精的日期，如IVF，GIFT，IUI，ICSI等。应通知患者下述事项：禁欲时间、取精时
　　间、送精液到实验室和标签的用法。医生同时应提供给患者一份"精液分析患者取精指南"。同时附上带有医
　　生签名的精液收集表，作为清洗精液的书面指示。另一份精液收集表则附在精液分析程序上。如果没有这份表
　　，应告知患者复印此表，在取精之前让患者充分阅读取精方法。

　　1． 患者应在取精前2-3天内禁止一切性活动，包括手淫。禁欲时间过长或过短，都会影响结果。
　　2． 患者取精前必须洗手，阴茎必须干净。

类型：
　　1． 精液经手淫法取得。
　　2． 精液需收集到无菌的精杯中（Corning cat # 25400250, or Baxter cat # C8827-4，或其他的经小
　　　　鼠合子质控合格的无胚胎毒性的杯子）。不能从家中带杯子来，需从医生处获得。为避免污染，杯盖只在
　　　　取精前打开。取精后，马上盖上盖子。不能触摸杯子的内部。如果取精后又泼出，绝对不能重新放入杯子
　　　　。在精液分析表中的问题中的问题2中注明。
　　3． 患者任何正在治疗的情况必须在精液收集表上注明。一些心脏病的药如钙离子通道阻断剂可能对精子有
　　　　毒害的作用。

处理条件：
　　1． 时间
　　　　a． 患者应在禁欲2-3天后取精。禁欲期间禁止一切性活动，包括手淫。
　　　　b． 精液取出1小时之内，必须送往实验室。最好在医院指定的位置取精。精液标本不能暴露在过高或过
　　　　　　低的温度中。运送精液应放在贴身体的部位保温。（不能放在包中或纸袋中）。如果不能在1小时之
　　　　　　内将精液送回实验室，或者精液常规结果不好（记数或活力太低），都应在医院的取精室内取精。这
　　　　　　样可能会取得较好的效果。
　　2． 在处理精液和精子的整个过程中，严格无菌的操作。 设备和材料：

设备：
　　1． 相差或微分干涉显微镜（例如Olympus, Nikon, Leica DMLS），或者是具有聚光镜的普通显微镜。
　　2． 370C培养箱。
　　3． 超净工作台II类，A型（例如Baker model no. SG-600）或者层流工作室（例如Baker Edgegard
　　　　models, Pure Aire
　　4． Corp，或其他）。层流空间应与工作量相符。
　　5． 2-80C冰箱（使用温度计每天记录温度）储存培养。
　　6． 台式离心机。（例如Clay Adams，Model Dynac II，cat.no. 0103）。
　　7． 370C水浴箱（例如Precision Scientific Model 182 cat.no.66643）。
　　8． 组织培养级的注射器、吸管、培养皿、培养瓶和滤器。
　　　　推荐使用的注射器应是全塑料的、无热源的、无润滑剂的类型，Air-Tite，Virginia Beach，VA出品。
　　　　吸管和培养皿是Falcon公司的（1 ml pipette cat.no.7521；5 ml pipette cat.no. 7543；10 ml
　　　　pipette cat.no.7551; tissue culture dish 60 x 15 mm cat.no.3002; petri dish 60 x 15 mm
　　　　cat.no.1007; organ culture dish cat.no.3037）。培养瓶Falcon出品（70 ml,cat.no.3082;250
　　　　ml, cat.no.3083）.滤器Gelman Sciences 出品（Acrodisc, pore size 0.2 um, cat.no.4192）。
　　　　配合1、5、10毫升移液管的手动或电动的移液器（例如Drummond Scientific, modesl no.400100）。
　　9． 带帽的、并可在外部标记的椎型离心管例如（Corning cat. no.25310-15 or Falcon cat.no.2099.
　　10．可调的移液枪和灭菌头（例如Elkay cat.no.000-PIPT-STR）。范围0-20 ul一个，0-200 ul一个（例
　　　　如Pipetman P-20 and P-200）。
　　11．载玻片和盖玻片（例如Makler Chamber, Sefi-Medical Instrumenst）
　　12．精子记数板（Makler Chamber, Sefi-Medical Instruments）
　　13．移液管-（Samco cat.no.P52144-10s）.

材料：
　　1． 添加5mg/ml人血清白蛋白HSA的Hepes-HTF（例如ART-1023，SAGE BioPharma），或者是实验自行配制
　　　　的培养液。
　　2． Percoll (Sigma Chemical Co cat.no.P 4937)和10x Hepes-HTF溶液（例如SAGE BioPharma），配
　　　　置等渗（90%）Percoll溶液。
　　3． Percollr的替代品也可以应用。SAGE BioPharma(PureCeption)，Irvine Scientific或
　　　　Scandinavian IVF公司均有提供，用法与Percoll相似。

准备：
　　1． 配制10%福尔马林溶液：在9份HEPES-HTF溶液中，加入1份福尔马林溶液（戊二醛浓度大约是40%，例如
　　　　Mallinckrodt cat.no.5016），配完后加入1mg/ml聚乙烯醇PVA（Sigma cat.no. P 8136）。
　　2． 添加5mg/ml人血液白蛋白的Hepes缓冲HTF（ART-1023）和碳酸盐缓冲的HTF（ART-1020，1026）。可作
　　　　用Quinn's HTF溶液配置。9.5毫升的HTF溶液中，加入0.5毫升的人血清白蛋白溶液（100mg白蛋白/毫升
　　　　溶液）。
　　3． 等渗Percoll溶液：1份10x Hepes-HTF添加到9份的Percoll溶液中。

应用须知：
　　培养液HTF和血清白蛋白HSA需经过小鼠合子的质控实验，囊胚率需高于80%。

储存须知：
　　1． 添加或不添加白蛋白的Hepes缓冲液可在出厂后2-80C保存12个月。在2-80C条件下储存的碳酸盐缓冲液
　　　　，自出厂后可保存70天。加入人血清白蛋白后，放入370C，6%CO2二氧化碳孵箱中，可最多保存4天。
　　2． 等渗Percoll：可在2-80C储存最多4周。

　　标签纸需是自动粘贴的并是可以拿下的，（如Avery Dennison, Product No. S-812）。标记使用铅笔，而
　　绝对不能使用记号笔。标记培养液成分和日期。

质量控制：
　　所有与精子接触的试剂如不同批号的培养液、血清、器皿等，均需经过小鼠合子的质控实验，囊胚率需高于
　　80%。培养箱也需经过相似的质控检验。

实验步骤：
　　I． 连续一步Percoll梯度法（正常精子样品的处理方法）。
　　　　1． 新鲜配置等渗Percoll（90% Percoll）1份（如1ml）10x Hepes-HTF添加到9份（如9ml）100%
　　　　　　Percoll溶液中。溶液保持在20C到80C，最多可保存1个月。使用前将温度提高到370C。
　　　　2． 在15毫升的椎型离心管中加入1.0毫升的90% Percoll○R。
　　　　3． 轻轻地将1.5 - 2.0 毫升的精液放置在Percoll○R 之上。解冻精液完全加热至370C，以获得最大
　　　　　　的精子活力。精液样本与PERCOLL不能混合。如果精液量大于2毫升，使用多个PERCOLL离心管。
　　　　4． 500 x g离心20分钟。如果样本比较粘稠，或记数较低，则应多离心10-20分钟。
　　　　5． 用注射器或吸管将PERCOLL和精液移开，注意不要碰到精子沉淀，则要在离心管中留0.4毫升的
　　　　　　PERCOLL，这样能够收集到溶在PERCOLL中的精子。
　　　　6． 使用注射器或吸管，加入3-5毫升的Quinn's○R精子清洗培养液（ART-1005/1006），用手指轻弹离
　　　　　　心管生悬沉淀。
　　　　7． 500 x g离心5分钟，洗掉剩余的Percoll○R。
　　　　8． 仔细地移掉上清液，将精子沉淀溶一定体积的培养液中。例如做IUI，则溶到0.4ml的Quinn's○R精
　　　　　　子清洗液中（ART-1006）。做IVF，溶到碳酸缓冲的培养液中如Quinn's○RHTF培养液中（ART-
　　　　　　1020，ART-1026），调好精子浓度。
　　II． 微型PERCOLL梯度（用于严重的少弱精，活精子总数少于5 x 106）
　　　　 1． 新鲜配置等渗Percoll（90% percoll）：1份（如ml）10 x Hepes-HTF添加到9份（如9ml）100%
　　　　　　 Percoll溶液中。
　　　　 2． 向90%的等渗PERCOLL中加入精子清洗液，配成下列的浓度。
　　　　 Percoll○R 密度
　　　　 梯度成分 45% 63% 85.5%
　　　　 90%等渗Percoll○R 2.0ml 2.8ml 3.8ml
　　　　 精子清洗液 2.0ml 1.2ml 0.2ml

　　　　 以上溶液保持在20到80C，最多可保存1个月。使用前将温度提高到370C。
　　　　 3． 在离心管底部加0.3ml 85.5%的Percoll溶液，使用一个新的吸管，在85.5%的PERCOLL上铺
　　　　　　 0.3ml的63% Percoll○R。最后，在63%PERCOLL上，铺0.3ml的45%Percoll○R完成。
　　　　 4． 精液在放到微型梯度之前，需经过"一步法"清洗。

　　　　"一步法"清洗步骤：
　　　　以精液：Quinn's○R精液清洗液（ART-1005/1006）=1：2的比例溶解精子。200 x g离心10分钟。吸掉
　　　　上清液，将精子沉淀溶到0.3毫升的培养液中。清洗后的精液可用来做微型PERCOLL梯度。

　　　　5．300 x g离心45分钟。
　　　　6．用注射器吸管将PERCOLL和精液移开，注意不要碰到精子沉淀。吸出时，从上到下吸，吸头的位置保
　　　　　 持在液面下。
　　　　7．使用注射器或吸管，加入2-3毫升的Quinn's○R精子清洗培养液，用手指轻弹离心管重悬沉淀。
　　　　8．500 x g离心5分钟洗去多余的Percoll○R。
　　　　9．仔细地移掉上清液，将精子沉淀溶到一定体积的培养液中，用于IVF或ICSI。

计算
A：）精子浓度的计算：
　　1． 将10%福尔马林溶液20微升放入12 x 75 mm的试管中（例如Falcon # 2054）。使用灭菌的枪或吸管吸取
　　　　20微升清洗后的精液。用吸管反复抽吸混均，滴一滴在血细胞记数板上（或者其他类型的精子记数板上
　　　　）。注意不要将精液溢了记数板。静置5分钟后，盖上盖玻片，400倍相差显微镜下观察。
　　2． 数尾部完整、圆形头部和正常形态的精子100个。如果能在一个中方格即16个小方格中查到100个正常的
　　　　精子，精子的数目就是足够的。如果稀释浓度比较低，则应数更多的中方格中的精子数。如果在25个中
　　　　方格中仍数不到100个正常精子，就必须将精子重新离心浓缩。
　　3． 精子浓度的计算：
　　　　精子浓度（/ml）=记数板方格中精子数目x 4 x106 x稀释倍数/记数的方格数。
　　　　例如精液以1：1的比例稀释，稀释倍数就是2。在16个方格中， 115条精子，最终的精子浓度为：
　　　　115 x 4 x 106 x 2
　　　　　　　　64
　　　　=57.5 x 106/ml
　　4． 活精子数等于精子浓度乘以活精子的百分率。例如，在上述标本中，精子的活力为85%，那么，活精子的
　　　　百分率就是：
　　　　57.5 x 106 x 0.85=48.9 x 106活精子/ml

B)：精液的稀释：
　　a) 正常精液的稀释：
　　　 - IVF：浓度保持在每30微升培养液中有25,000 - 40,000条活精子。
　　　 - GIFT：每次移植100,000条活精子。
　　b) 冷冻精子：
　　　 - IVF：浓度保持在每30微升培养液中有100,000条活精子。
　　　 - GIFT：25微升体积中，保证有最多的精子数。精子数一般多于100,000条，有时达到500,000 to
　　　　 600,000条。
　　c) 男性因素的病人：（精子记数小于20 x 106/ml，精子活力小于40%，正常精子比率小于30%）
　　　 - IVF：浓度保持在每30微升培养液中有20,000条活精子左右，依据精子的质量而做适当的调整。
　　　 - GIFT：25微升体积中，保证有最多的精子数。

C）：精子稀释倍数的计算
　　 1． 如果清洗精子的浓度大于20 x 106 /ml，取20ul精液，用培养液将精子浓度调至4 x 106/ml做GIFT，
　　　　 或5 - 8 x 106/ml做IVF。
　　　　 例如精子的最终浓度为35 x 106活精子/ml，那么，20ul稀释液中含有0.02 x 35 x 106 =0.7 x
　　　　 106条精子。如果做GIFT，0.7 x 106条精子在Y毫升（=0.02 + x）培养液中的精子浓度是4 x 106。
　　　　 那么，Y=0.7/4=0.175
　　　　　　　 Y=0.02 + x=0.175
　　　　　　　 x=0.175 - 0.02=0.155

　　　　 因此，将20ul稀释液放入0.155ml的培养液中。
　　　　 总的算式是：0.02 x 35/4=0.175 - 0.02=0.155

　　　　 注意：做GIFT，使用25ul精液稀释液。剩余的12.5ul稀释液做多余卵子的IVF。做IVF，精子最终浓度
　　　　 需达到5 - 8 x 106/ml,这样，当加5ul稀释液到受精滴中时，每滴中则含有25,000到40,000条活精子
　　　
　　　2． 如果精液样本精子记数少于20 x 106活精子/ml时。
　　　　　例如：终浓度为12 x 106活精子/m

　　　　　GIFT：计算4 x 106条精子的体积：
　　　　　ie 4 x 106 /12 x 106=0.33ml
　　　　　调至1ml体积的培养液用量：
　　　　　ie 1.0 - 0.33 =0.67ml
　　　　　这样，将0.33ml的精子悬浮液添加到0.67ml的培养液中，这样，在1ml的培养液中，含有4 x 106条精
　　　　　子。

　　　　　IVF：计算5 x 106条精子的体积。
　　　　　ie x 106 /12 x 106=0.42ml

　　　　　调至1ml体积的培养液用量：
　　　　　ie, 1.0 - 0.42 = 0.58ml
　　　　　这样，将0.42ml的精子悬浮液添加到0.58ml的培养液中，这样，在1ml的培养液中含水有5 x 106条精
　　　　　子。

结果的报告：
　　需报告的结果包括清洗精子的浓度，精子活力，形态学。根据采取不同的辅助受精手段，添加所需的指标。

参考范围：
　　参考文献：WHO laboratory manual for the examination of human semen and semen-cervical
　　mucus interaction, WHO 1992, 3rd edition, Cambridge University Press。

　　体积：大于2毫升。
　　PH值：7.2 - 8.0。如果大于8.0，应怀疑感染；如果小于7.0，同时精子记数低（记数低于5 x 106/ml），
　　应怀疑输精管、精囊或附睾的病变。

　　精子浓度：至少20 x 106/ml。

　　总精子数：多于40 x 106。

　　活力：
　　　　 a) 50%以上的前进运动精子。包括一级和二级精子。一级精子：快速直线前进运动。二级：慢速直线或　　　　　　非直线运动。

　　 　　b)25%以上的一级精子。

　　形态：
　　　　 30%以上正常形态的精子。

　　白细胞数：
　　　　 少于1 x 106/ml。

异常结果的程序：
　　如果没有获得足够数量的精子，应采取以下的步骤：
　　1． 应在第一次取精后2 - 4 小时，进行第二次取精。如果第二次取精也没有得到足够的精子数，那么：
　　2． 应重新考虑辅助受精的手段，例如用ICSI替代常规的IVF。采用的方法，需经患者的医生、实验室主任以
　　　　及其他人员协商后，征得患者同意后，达成一致意见。

报告格式：
　　在最后的报告中，应报告冻融精子的浓度、活力、形态以及采取辅助生殖技术有关的数据。

注意：
　　1． 处理精液样本的整个过程需要无菌，并采取常规的防止感染的措施。
　　2． 一些特殊状况会影响精液处理结果，例如禁欲时间过短、身体或情感的刺激、呼吸道感染引发的疲劳等
　　3． 精液处理结果记录应与辅助受精部门的记录合并存档。

样本的抛弃：
　　所有的体液标本以及实验室弃物均应放在标有"生物危害品"的容器内，按程序规定抛弃。

程序中禁忌点：
　　干扰物质
　　污染的精杯可能会影响精子的活力。必须使用组织培养级并通过质量检测的精杯。一些药物如心脏病使用的钙
　　离子阻断剂等，也会影响精子的活力。

　　如果由于精子的数目、活力、形态或其他原因失败，下个周期应考虑使用ICSI。

参考文献：
　　QUINN P (1993). Sperm processing in assisted reproductive technology male factor. Seminars
　　Reprod Endocrin, 11:49-55.

附录I
程序名称：逆向射精病人精子的回收：
I．总则：
　　逆向射精通常将精液射向膀胱中。为了在膀胱中回收活精子，就必须保持膀胱的良好环境。
II．已经诊断为逆向射精或怀疑逆向射精患者，在射精后马上取尿。同时，也有一些精液射出，应单独处理。 III．材料和试剂：
　　1． 灭菌的10、25ml血清管（Falcon）。
　　2． 灭菌的120ml取精杯（Baxter）。
　　3． 灭菌的15或50ml离心管（Falcon）。
　　4． 灭菌的巴氏吸管。
　　5． 离心机。
　　6． PH计。
　　7． 渗透压计。
IV．程序：
　　1． 患者在取精24小时之前服用小苏打片。常用的剂量是每天4次，每次4片（1克一片）。在取精前一天服用
　　　　。其作用是使尿液呈碱性，精子更易存活。
　　2． 取精在早晨进行。但晨尿的浓度比较高。因此，患者应该在起床排尿后，喝8盎司的水（喝茶也可以，但
　　　　不能喝咖啡、果汁和苏打水）。在进实验室取精之前，再喝8盎司的水。这样，能够最大限度地降低尿液
　　　　的渗透压。
　　3． 患者到达实验室以后，取一份比较少的尿样。检查PH值和渗透压。理想的PH范围是6.5-8.5，理想的渗透
　　　　压范围是280-290。如果渗透压太高，让患者再喝一杯水。等15分钟以后，重新检查尿液的PH值和渗透压
　　　　。整个过程需要1小时左右。
　　4． 当PH值和渗透压范围达到要求后，患者取精后马上排尿，收集尿液。
　　5． 使用精液分析或IUI的精液清洗程序处理精液。
　　6． 将尿液收集到离心管中，500 x g离心机20分钟。
　　7． 去上清，收集精子沉淀。在4ml添加5mg/ml HSA的Hepes-HTF或精子清洗液重悬精子。500 x g离心
　　　　minutes。
　　8． 去上清，剩余培养液约1.0ml，按精液分析或IUI的精液程序记数。