临床意义：
　　人类IVF程序是建立在鼠体外受精程序的基础上。此技术用于人类的第一个临床指征为女性患者输卵管阻塞或
　　输卵管损伤阻碍精卵自然结合。方法发展为1）用促排卵药物刺激卵巢，增加可被收集的成熟卵母细胞的数量
　　。2）通过腹腔镜或超声引导穿刺取出卵母细胞。3）精卵在体外培养获得较高的受精率和胚胎形成率。4）将
　　胚胎移植到子宫。IVF的指征随后被用于其他原因的不孕，包括子宫内膜炎，输卵管粘连，内分泌黄体阶段不
　　足，子宫解剖结构异常，男性因素，精液抗体和原发性（原因不明）不孕。

样本：
患者准备：
　　女性患者：女方应用先用促排卵药物刺激卵巢，促进卵泡发育，最后注射hCG促卵泡成熟。注射hCG后36小时
　　应进行取卵。应在取卵时间填写在取卵单，及促排检测单。

患者登记：
　　　　在患者取卵前应填写实验室登记表。表中应包括取卵单，促排检测单（计算机生成的数据表），精液检查
　　单/其他检查单。患者情况应该仔细而完全的记录。取卵前将患者的登记表与患者的手牌号（如果使用）再次
　　核对并做口头证实由两个人（其中一名为取卵的技术员）在取卵单上签名。
　　　　标签纸需是自动粘贴的并是可以拿下的，（如Avery Dennison, Product No. S-812），标记和日期。
　　移植时实验员应与患者和医生或其助手核实患者的姓名。

男性患者：
　　　　女方取卵后男方应该提供精液标本。男方应禁欲2-5天。取精前用温水和香皂洗手并擦干。应使患者了解
　　收集标本的注意事项。精液收集表内容包括患者姓名，出生日期，标本采集日，禁欲时间，标本是否采集完全
　　，近期服用药物名称。

标本核对：
　　实验员将患者的精液带入实验室并核实患者的姓名将其记录到卵子记录单上。患者将精液容器盖好并在容器及
　　盖子写下自己的姓名，取精日期。如果使用得冷冻复苏精液，在复苏前实验室的技师和医生办公室的技师同时
　　在场，共同确认精液来源，并在取卵单上精子制备部分签名字。

操作常规和处理条件：
女性患者：
　　卵泡液被吸入14ml的无菌组织培养管中（Elkay cat #0002057 STR或Falcon cat #2057）交给实验室技师
　　。从卵子取出到放入培养箱中的过程尽可能的保持卵子的温度在37度。

男性患者：
　　精液尽可能的以手淫的方法获得，保存在无菌容器中（Corning cat # 25400250，或Baxter cat # C8827-
　　4，或类似的经过鼠胚培养实验的无胚胎毒性的容器中）。精液在室温条件下在45分钟内液化，液化后洗涤。

处理条件：
　　对于所有患者，在处理精液，精子，卵子和胚胎时都应视之为有潜在的传染可能的标本，并时时小心无菌处理

设备和材料：
设备：
取卵时：
　　1、 改良的新生儿人工抚育器（如Airshields model no. C200）设定到37度，储水槽中加入无菌组织培养
　　　　级水以增加湿度。配有冷光源的解剖显微镜（Olympus, Wild 或Nikon）置于安装有CO2控制系统（
　　　　Forma Scientific Model No.3057）的抚育器中，保证工作时CO2的浓度为6%并在抚育器中加入25mM
　　　　HCO3-缓冲液。

　　　　其他的实验室配置也可以，但是不论使用何种系统都要保证在操作过程中卵子和胚胎始终在温暖潮湿的环
　　　　境中，需要时培养皿要在6%的CO2的环境中。如果显微镜不是放在像上面所写的那样，将它放入前面描写
　　　　的环境中。

　　2、 负压吸引器产生150-200mmHg的负压（如：Rocket of London或其它类似产品）。
　　3、 恒温试管架，用于14ml试管保温（Thermolyne Model No.DB 16525）。
　　4、 不锈钢金属试管架（如：Baxter cat.No.S9229-3）。
　　　　将塞子插入金属试管架的3和4层上面是用高温灭菌后放在无菌区，在取卵时由清洁护士传。
　　5、 取卵针（如：Gynetics #4551，或Cook cat no.KDOPU-173501）和B超导向器。
　　6、 2 x 50ml塑料管（如：Falcon #2070，或Baxter #C3920-50）；单个无菌双层装，环氧乙烷消毒，可
　　　　以在空气中暴露至少7天。
　　7、 2 x 20ml全塑料无菌（刻度）注射器。
　　8、 收集卵泡液的17 x 100mm 14 ml无菌塑料带盖试管（如：Elkay cat #002057 STR,或Falcon cat
　　　　#2057.
　　9、 超声石蜡油（eg SweMed cat no.4540）。
　　10、 无菌，无精子避孕套内加入10-15ml超声石油后套在B超探头上。

IVF 实验室：
　　1、 培养箱--选择37度有水槽的CO2培养箱。最好选密闭的静态培养环境
　　　　或持续供汽设置，带水槽的培养设置为6%CO2, 5%O2, 89%N2.常规5%的CO2培养箱设置为6%也可以使用，
　　　　但不是最好的。密闭静态的培养环境系统由塑胶玻璃室制成并充入特殊的气体成份（如6%CO2：5%O2：
　　　　89%N2），密封后放入37度培养箱内。塑胶玻璃室在10 psi下充气3分钟。塑胶玻璃室在Billups-
　　　　Rothenberg,P.O.Box 977,DelMar,CA 92014-0977,USA;email bir@mill.net ;FAX 619-755-3455购
　　　　买。
　　2、 净工作台II类，A型（例如Baker model no. SG-600）或者层流工作者（例如：Baker Edgegard
　　　　models，Pure Aire Corp,或其他）。层流空间应与工作量相符。
　　3、 2-80C冰箱（使用温度计每天记录温度）储存培养液。
　　4、 台式离心机。（例如Clay Adams, Model Dynac II，cat. No. 0103）。
　　5、 370C水浴箱（例如Precision Scientific Model 182 cat no. 66643）。
　　6、 组织培养级的注射器、吸管、培养皿、培养瓶和滤器。
　　　　推荐使用的注射器应是全塑料的、无热源的、无润滑剂的类型，Air-Tite，Virginia Beach，Va出品。
　　　　吸管和培养皿是Falcon公司的（1 ml pipette cat. no. 7521；5ml pipette cat.no. 7543；10ml
　　　　pipette cat.no. 7551；tissue　culture dish 60 x 15 mm cat. no. 3002; petri dish 60x15
　　　　mm cat. no. 1007; organ culture dish cat.no. 3037）培养瓶Falcon出品（70ml，cat.no.
　　　　3082；250ml，　　　cat.no. 3083）.滤器毫升移液管的手动或电动的移液器（例如Drummond
　　　　Scientific,model no.400100）。
　　7、 5.75或9英寸玻璃巴斯特滴管（如：Corning cat.no.7095B-5x 及7095B时-9或Kimax cat.
　　　　no.72050575ey 72050900）:组织培养级水冲洗加热消毒。使用酒精或丙烷加热将滴管头部拉细。
　　８、可调的移液枪和灭菌吸头（例如 Elkay cat. no. 000-PIPT-STR）。范围0-20ul一个，0-200ul一个（
　　　　例如Pipetman P-20 and P-200）。

胚胎移植：
　　1、 软胚胎移植管（Gynetics 2000 Set，或Cook OB-GYN，cat.no. J-TFCT-302000，或Wallace,或COOK
　　　　Ob-Gyn Soft-trans　catheter），1 x 1ml刻度注射器和1 x 1 cc Becton Dickinson 结核菌注射器

试剂：
　　1、 商品化的IVF培养液如Quinn's Advantage 受精液，或Quinn's Advantage卵裂液，或Quinn's
　　　　Advantage囊胚液，HEPES-缓冲的HTF（SAGE BioPharma，San Clemente，CA）或自制的类似的培养液
　　2、 人血清白蛋白（HSA）；（SAGE BioPharma）。
　　3、 石蜡油[每一批必须做鼠胚培养实验]（ART-4008，SAGE BioPharma ）.使用10%（体积比）的HCO3缓冲
　　　　的HTF平衡，放到6%CO2培养箱中过夜，更换新鲜培养液，松开瓶口平衡。

准备：
　　1、 无菌操作：流净化工作台内放置新生儿人工抚育器，其中包括解剖显微镜，每天使用前用纸巾或棉布手
　　　　巾沾70%酒精擦拭。完成一次取卵后用组织培养级水擦去血迹和其它液体，然后用70%酒精擦拭。
　　2、 HCO3缓冲的HTF培养液：取卵前一天的下午制备，使用前平衡12-24小时制备方法：9.5ml HTF（ART-
　　　　1020或ART-1026）中加入0.5ml HAS (ART-3001)液（HSA的浓度为100mg/ml）准备受精/培养皿（最多
　　　　三个取决于预期取卵数），在60 x 15mm组织培养皿中用加样器加入10个30ul的微滴，用已平衡的矿物油
　　　　覆盖皿上标记培养液的名称和准备日期，置于6%CO2，5%O2和89%N2的培养箱中37度平衡过夜。培养皿的
　　　　盖子向左侧倾斜便于气体交换。 Medium受精液（ART-1020），D1-D3选用Quinn's Advantage
　　　　Cleverage Medium卵裂液（ART-1026），从D3-D5/D6选用Quinn's Advantage Blastocyst Medium囊
　　　　胚液（ART-1029）。其它公司有各自的序贯培养液。
　　3、 卵泡冲洗液：这种培养液使用前几个小时制备。每100ml HEPES-缓冲的HTF中（ART-1023）加入肝素
　　　　3,000U（30U/ml），做标记'+hep'并标记日期后放入37度水浴箱中。使用前放入新生儿人工抚育器中。
　　　　依据预期取卵数制备1-4瓶，每瓶1-100ml。
　　4、 卵子采集皿：准备10ml加入5mg/ml HSA的HEPES-缓冲的HTF，在培养皿中央加入1ml HTF，用1.5ml矿物
　　　　油覆盖。在外圈加入5ml不含蛋白的HEPES-缓冲的HTF。依据预期取卵数制备4-6个皿，标记为1-4（或
　　　　6），放在新生儿人工抚育器中显微镜的左侧
　　 5、卵子转运管：只有在附属实验室取卵要向中心实验室转运时才需要准备。运输时间不要超过1-2小时。
　　　　准备10ml加入5mg/ml HSA的HEPES-缓冲的HTF，在17 x 100mm的培养管中加入1ml培养液后用1ml矿物油
　　　　覆盖，扣紧盖子。准备4-6个这样的管子将它们放在37度的转运培养箱（如：Labotect Model no.
　　　　3016）内的架子上。
　　6、 打开新生儿人工抚育器：设置温度为37度，水槽中加入组织培养级水，前端光滑的无菌的5.75"巴斯特滴
　　　　管内部插入乳胶球。打开用于寻找卵子的60 x15 mm培养皿的包装，将培养皿置于新生儿人工抚育器中显
　　　　微镜左侧的苯乙烯泡沫上。将试管架（Thermolyne cat.no.BKI165X8A）和含有肝素的100ml HEPES-缓
　　　　冲的HTF瓶一起放在显微镜的左侧。一瓶50-100ml用于冲洗患者阴道的HEPES-缓冲的HTF也放在抚育器中
　　7、 胚胎移植：用7ml HEPES-缓冲的HTF和3ml含100mg/ml的HSA溶液配置成含有30mg/ml HSA的HEPES-缓冲
　　　　的HTF 10ml。取该溶剂1 ml放入培养皿的中央，用1.5ml已平衡的矿物油覆盖。其余溶液放入培养皿的
　　　　外围。制备好的培养皿置于37摄氏度新生儿人工抚育器待用。

储存要求：
　　如果不使用，所有不含蛋白质的溶液在2-8摄氏度条件下保存4周即需抛弃。如果加入了HSA，HCO3缓冲的培养
　　液在37度6%CO2的培养箱中最多保存2天HCO3缓冲的培养液在储存前必须在5-6%的CO2条件下充气平衡3-5分钟

　　在50ml的培养瓶中的培养液再次平衡的推荐方法是：
　　　　a. 含有5%或6%CO2或其它特定的混合气体如5-6%CO2，5%O2，其余气体为N2的箱子。
　　　　b. 箱子充气的塑料管中间需要添加0.2um的滤器。
　　　　c. 在塑料管的末端添加一个1ml的无菌刻度滴管。
　　　　d. 将含培养液的培养瓶放在层流罩或生物安全箱内。将无菌刻度滴管插入培养液内通入CO2气3-5分钟，
　　　　　 这时培养液内的酚红显示玫瑰红色。
　　　　e. 停止通气，取出无菌刻度滴管，盖紧培养瓶的盖子，立即放在2-8度冰箱中。
　　
　　标签纸需是自动粘贴的并是可以拿下的，（如Avery Dennison，Product No. S-812），标记使用铅笔。或
　　在玻璃容器的外面使用钻石笔标记而绝对不能使用记号笔。含培养液的试管和培养皿要记录成分，制备日期。

质量控制：
　　每一批培养液，HSA和其它配子，胚胎接触的材料必须做鼠胚胎培养实验，至少80%的鼠胚能发育到完全扩张
　　的囊胚。养箱也必须做类似的质量控制实验。

详细步骤：
　　1、 进入取卵室，在两个50ml的试管中加满含30U/ml 的肝素的HEPES-缓冲的HTF（ART-1023），放在干式加
　　　　热箱中。取卵针与负压泵连接并用5-10ml HEPES-缓冲的HTF冲洗，冲洗的液体丢。

　　2、 卵泡液通过负压被吸入17 x 100 mm的试管内，放在恒温试管架或立即交给实验室操作员（胚胎学家）放
　　　　在新生儿人工抚育器内。试管内容物立即全部倒入60 x 15mm的皿中。解剖显微镜低倍镜下寻找卵-冠-丘
　　　　复合物（OCC），用巴斯特滴管利用移液器产生的负压将卵子取出，在卵子采集皿的外围培养液的一侧第
　　　　一次冲洗然后在另一侧冲洗，尽可能的稀释血细胞和其它碎片，然后将卵-冠-丘复合物放在皿中央被油
　　　　覆盖的培养液中。

　　3、 卵-冠-复合物在卵子或移到卵子收集皿时评估卵子的成熟度。根据颗粒细胞和放射冠评价卵子的成熟度
　　　　；2级-分散的中等或大量的颗粒细胞，和部分分散的放射冠；1级-颗粒细胞较少，放射冠紧密，无光环
　　　　；0级-无或极少的颗粒细胞，放射冠缺失或紧密。

　　4、 卵子收集完毕后将培养皿从新生儿人工抚育器中转移到IVF实验室。卵-冠-丘复合物被大量的颗粒细胞包
　　　　裹，在受精前用26号针头连接1ml注射器尽可能多的剥离颗粒细胞，血块，如果放射冠平均直径超过3-
　　　　5mm需要剥离部分放射冠。通常每个30ul的HCO3缓冲的培养液中只放一个卵-冠-丘复合物，但是如果空间
　　　　足够的话，最多可以放4个卵。卵-冠-丘复合物从卵子收集液移到受精液时会携带极少量的卵子收集液。
　　　　如果卵-冠-丘复合物需要在转运管内转运，用巴斯特滴管利用加样器产生的负压将卵-冠-丘复合物移到
　　　　培养皿的中央孔内，然后象本段开始描述的那样处理卵-冠-丘复合物。小心的用巴斯特滴管移去受精滴
　　　　中的气泡和油滴。将受精的培养皿移到培养箱中3-8小时（平均4-6小时）后受精。

　　5、 2级卵-冠-丘复合物在肌注hCG 38-44小时后受精（即如果肌注hCG 36小时后取卵，取卵后2-8小时受精
　　　　）。1级卵-冠-丘复合物依据成熟程度在取卵后18-24小时受精。
　　
　　6、 卵子受精：取卵后2小时内男方取精。取精前禁欲2-5天，将精液收集到无菌容器内（如Corning
　　　　#25400250），杯盖和侧面都要由患者写上自己姓。精液液化后（室温液化时间不能超过45分钟）用密
　　　　度-梯离心法（PureCeption,Sage BioPharma））处理精液，离心后的精液用培养液（ART-1005/6，
　　　　Sage BioPharma）离心洗涤一次，加入适量的培养液调整活精密度为5-8 x 109，将受精培养皿放到新
　　　　生儿人工抚育器中（CO2浓度为6%）用Pipetman P-20可调微量加样器在受精滴中加入5ul 即加入25
　　　　,000到40,000条精子。常规受精HTF(ART-1020)中加入25,000条精子，卵裂HTF（ART-1026）中需加
　　　　40,000条活精子；冷冻复苏精子的密度是正常的2倍，少、弱、畸形精子密度加到最大，即每个卵加10-
　　　　20万条精子。卵子可以组合培养，如果需要可以增加精子量和/或用26号针头或80U/ml透明质酸酶去处粘
　　　　液团减少卵子外围的膜阻力，增加低质量精液标本的受精机会。

　　7、 观察受精和胚胎培养：受精后的第二天早8:00-中午12:00在6%CO2的新生儿人工抚育器内观察受精情况
　　　　，将玻璃巴斯特滴管拉细到内径比卵-冠-丘复合物的直径稍大，用口控制口吸管产生的负压吹打卵-冠-
　　　　丘复合物至放射冠和卵子分离，这样能够清晰的观察胞浆中的原核和极体。口吸管中间加0.2um的 滤器
　　　　防治污染。正常受精的卵子有两个积聚的原核，将其放入新的30ul的培养液中或放入颗粒细胞附着皿底
　　　　血细胞污染最少的培养滴中。超过两个原核的卵子继续培养，观察它们的发育情况，6天后丢弃。未受精
　　　　的卵子放在一个受精滴中再次受精或改行ICSI。第二天早晨观察受精情况，如果没有受精或受精后不继
　　　　续发育6天后丢弃。

　　　　受精的卵子在另一个培养箱中培养6天，依据可用胚胎的数量和形态学质量选择冷冻或移植。如果有5个
　　　　或少于5个可用的胚胎，建议在原核期或2-4细胞期移植。如果有超过6个可用的胚胎可以在D3（D1=原核
　　　　期）8细胞阶段移植。冷冻通常在D6如果胚胎发育到完全扩张囊胚阶段。也可以选择在原核期到2-8细胞
　　　　阶段。胚胎可以移到为D3（8-12细胞阶段）特殊设计的培养液中（ART-1029）。这种培养液在使用前制
　　　　备好并在培养箱中平衡过夜。

　　　　推荐在IVF的不同发育阶段使用不同的培养液；例如，受精选用Quinn's Advantage Fertilization
　　　　Medium(ART-1020)，D1-D3选用Quinn's Advantage Cleverage Mediun(ART-1026)，从D3-D5/D6选用
　　　　Quinn's Advantage astocytes　Medium(ART-1029)。其它公司有各自的序贯培养液。

8、 胚胎移植：
　　i、将新生儿人工抚育器的CO2设置为6%，在解剖显微镜下选择形态学质量最好的需要移植的胚胎移到含有移
　　　 植培养的培养皿中
　　ii、将胚胎移植管和注射器放在35-37度的热台上下面用无菌纱布或纸垫上。 胚移植管从外包装中取出，如
　　　　果是包装纸，剪的比移植管短5mm。样移植管末端包在包装纸内保持无菌。用刻度注射器取培养皿外围的
　　　　培养液 0.7ml，将培养液完全的推入移植管内，这样移植管既被冲洗内部又完全 充满了培养液。再次吸
　　　　取培养皿外围的培养液0.5-0.7ml冲洗移植管。将刻度注射器移走，用培养皿外围的培养液冲洗1ml
　　　　Becton-Dickinson syringe两次后接到移植管上。标记物放在胚胎移植管的狭窄处，比测的子宫深弃大
　　　　约少1cm。将0.03ml的空气注入移植管，气液交界面在标记物上方。随后吸入含有胚胎的少于0.01ml培养
　　　　液（移植管内的长度小于1cm，随后吸入0.01ml空气，最后吸入0.005ml的培养液，将注射器推到底使胚
　　　　胎，培养液，空气全部推入子宫。总量小于0.06ml。这种方法适合于大多数的胚胎移值管，由于移植管
　　　　内充满以液体产生的液体压力更易于将移植管的内容物推出。
　　iii、含有胚胎的移植管放到外包装纸内可以保持无菌，小心的去外包装纸将移植管交给医师。患者采用膀胱
　　　　结石位，将脚放在脚踏上，医师用棉签沾湿的HEPES缓冲的HTF（ART-1023）擦拭宫颈外口，将移植管插
　　　　入宫颈外口轻轻的通过宫颈插入子宫腔直到移植的标记部位。如果有阻力，可以在宫颈钳的牵拉下帮助移
　　　　植管通过宫颈。移植管放置好后轻轻的将注射器推到底停留10-60秒保证胚胎进入宫腔。移植管旋转90度
　　　　缓慢的退出宫颈。医师将移植交给胚胎学家在显微镜下在培养皿的中央反复冲洗移植管几次检查是否有胚
　　　　胎残留。
　　iv、将胚胎移植的数目、分级、日期、时间、移植难易以及其它相关的事项记录到实验室记录表。

计算结果：
　　实验室记录由手写或计算机完成。记录包括多种参数，如受精率、妊娠率、着床率等等，最少每月统计回顾一
　　次。

结果的报告：
　　一份完整的实验室记录和冷冻记录（如果胚胎有冷冻）交给医师，另一份记录保存在实验留作病例讨论。实验
　　记录最少保存2年

注意事项：
全过程中的主要问题是低质量的培养条件，主要包括：
　　1、 低质量的培养液：通过合适的质量控制实验选择
　　2、 质量的培养环境，通常是频繁开关培养箱门导致CO2浓度过底或经常改变：校正选用密闭的培养环境（如
　　　　Billups-Rothenberg Chamber），或选用分体（门）式培养箱开门时只取放有配子或胚胎的培养皿，或
　　　　使用充气快的培养箱，开门后10分钟内气体升到5%检测培养箱内CO2浓度。
　　3、 应选用红外红CO2检测器而不是Fyrite检测器。
　　4、 患者不可以进入IVF实验室监测卵泡，胚胎和移植。AFS"人类胚胎和男性实验室指导方针"Fertil
　　　　Steril 58:Suppl1,p7s,para 7e, 1992)

参考范围：
　　平均每个患者取11-12个卵子。约80%应是成熟的，成熟卵的受精率在50-90%正常精液不受精的发生率
　　应<10%。多精受精率应<10%。临床妊娠率大于20%并且其中的70%以上能够继续发育。70%有胚胎剩余患者有
　　一个以上的胚胎发育到完全扩张的囊胚并可以用于冷冻。

异常结果的处理：
　　如果上面正常标准超过两个月没有达到，整个实验室系统应被彻底清洁，仪器重新组装，再次开展人类IVF之
　　前用鼠胚培养实验进行质量检测。

报告格式：
　　使用Q&A计算机程序下的EGGDATA.DTF,CRYO.DTF和PROGOUT.DTF文件中的IVF实验室报告表或其它类似的软件
　　系统收集数据，或使用与Q&A计算程序一样的拷贝。（空白表格见#P002"患者检查管理"）。

样本的抛弃：
　　所有的体液标本以及实验室弃物均应放在标有"生物危害品"的容器内，按程序规定抛弃。

程序中的禁忌点：
　　如果精液标本在密度上，活力上，形态上或其它未知因素不适合于IVF，在下一个治疗周期应使用单精子卵细
　　胞内注射（ICSI）处置以获得满意的受精率。

　　未知卵子或胚胎的因素导致患者不怀孕。如果治疗人个周期未获得妊娠，男方精子与剩余卵子利用IVF能够发
　　生受精，并且所有导致失败的因素都已经被处理后，她们的医生应该建议她们采用供卵或供胚，领养孩子和
　　/或停止采用IVF治疗。

参考文献：
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　　　 IVF. J Assisted Reprod Genetices 11:270-277.
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　　　 human tubal fluid medium lacking glucose and phosphate. J Assisted Reprod Genetics,
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　　4. American Fertility Society (1992). Guidelines for human embryology and andrology
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